NOB – Diagnostyka koronawirusa

Badania wykorzystania biorezonansu w diagnostyce koronawirusa u kotów.

Porównanie wydajności biorezonansu, elektroforezy i PCR w czasie rzeczywistym w diagnostyce zakaźnego zapalenia otrzewnej kotów

Farsijani F,1 Safi S,1* and Shirazi Beheshtiha S. H2

Razi Vaccine & Serum Research Institute, Alborz,IRAN

Published online 2023 Jun 30

Abstrakt

Zakaźne zapalenie otrzewnej kotów (FIP) nadal jest jedną z najczęściej badanych chorób zakaźnych kotów. Diagnoza FIP jest trudna i opracowano różnorodne techniki jego dokładnej diagnozy. Mają jednak pewne ograniczenia. Niniejsze badanie przeprowadzono w celu zbadania skuteczności częstotliwości o specyficznej modulacji (SMF) w porównaniu z innymi tradycyjnymi metodami diagnostycznymi do wykrywania kociego koronawirusa. Próbki krwi pobrano od 30 chorych kotów podejrzanych o FIP na podstawie objawów klinicznych. Dla każdej próbki przeprowadzono elektroforezę, reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) i testy SMF. Czułość i swoistość każdego testu, a także zgodność między testami a złotym standardem (połączenie wyników PCR, elektroforezy i biorezonansu) obliczono metodą współczynnika Kappa. Czułość i swoistość elektroforezy, PCR i SMF w diagnostyce FIP wynosiły odpowiednio 70,6%, 70,6%, 100% i 100%, 72,7%, 81,8%. Zgodnie z ustaleniami niniejszego badania SMF jest skuteczny i bezpieczny w diagnostyce FIP, co stanowi wyzwanie w diagnostyce Medycyny Weterynaryjnej.

1. Wprowadzenie

Zakaźne zapalenie otrzewnej kotów (FIP) jest śmiertelną chorobą o podłożu immunologicznym wywołaną zakażeniem koronawirusem kotów (FCoV). FCoV należy do rodziny Coronaviridae, grupy otoczkowych wirusów RNA o dodatniej nici, często występujących u kotów. Powoduje infekcję jelitową, która prowadzi do śmiertelnej, ogólnoustrojowej choroby o nazwie FIP, postępującego zapalenia WIELOSEZONOWEGO o podłożu immunologicznym i ropniakowatości. Występuje na całym świecie, dotykając zarówno kotowatych domowych, jak i dzikich, i jest niezwykle powszechny w zatłoczonych środowiskach ( 1 ).

Szczepy FCoV dzielą się na dwa odrębne biotypy: koronawirus jelit kotów i wirus zakaźnego zapalenia otrzewnej kotów (FIPV). Serotyp 1 fcov obejmuje unikalne szczepy kotów, podczas gdy wydaje się, że serotyp 2 powstał w wyniku rekombinacji między FCoV typu 1 a koronawirusem psów. Chociaż serotyp 1 jest najbardziej rozpowszechniony na świecie, zarówno serotypy 1, jak i 2 mogą powodować FIP. U kotów z FIP wirus replikuje się do wysokich mian w monocytach i można go znaleźć w wielu narządach. Z drugiej strony u kotów bezobjawowych FCoV ogranicza się głównie do jelita. Jednak niski poziom wiremii związanej z monocytami można czasami wykryć u zdrowych zwierząt za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy odwrotnej transkryptazy (RT-PCR) ( 2 ).

Wiele razy ogólne objawy kliniczne FIP (takie jak przewlekła gorączka, utrata masy ciała, anoreksja i złe samopoczucie) są niespecyficzne. Dlatego FIP jest śmiertelną chorobą, która powoduje wiele wyzwań dla weterynarzy. Trudności w ostatecznym diagnozowaniu FIP wynikają z jego niespecyficznych objawów klinicznych, braku patognomonicznych nieprawidłowości hematologicznych i biochemicznych, a także niskiej czułości i swoistości testów rutynowo stosowanych w praktyce. Istnieje kilka technik diagnostycznych do klinicznego wykrywania FIP. Zmiany kliniczno-patologiczne w FIP (w tym limfopenia, neutrofilia, niedokrwistość, hiperproteinemia i hipergammaglobulinemia) nie są patognomoniczne (3 ).

Enzymy wątrobowe, mocznik i kreatynina mogą być podwyższone w zależności od stopnia i miejsca uszkodzenia narządów, ale generalnie nie są przydatne w ustalaniu diagnozy ( 4 ).

Elektroforeza białek surowicy (SPE) to klasyczny test pośredni stosowany do wspomagania diagnozy FIP. Jednym z najbardziej potwierdzających wyników w diagnozowaniu FIP jest zwiększone całkowite stężenie białka w surowicy wraz ze zmniejszonym stosunkiem albuminy do globuliny ( 5 ). Wzór elektroforetyczny FIP charakteryzuje się zwykle wzrostem frakcji Alfa (α)2 i gamma (γ)-globuliny ( 6 ).

Chociaż RT-PCR może często dawać fałszywie dodatnie i fałszywie ujemne wyniki u zdrowych kotów, może być specyficznym narzędziem do diagnozowania FIP, gdy jest stosowany w warunkach klinicznych ( 7 ).

Terapia biorezonansowa MORA ( tradycyjna terapia biorezonansowa) została opracowana przez lekarza Franza Morella i technika elektrotechniki Ericha Rasche w latach 70.

Fale elektromagnetyczne są wykorzystywane do diagnozowania i leczenia w terapii biorezonansowej (zwanej również terapią bioinformacyjną). Biorezonansowy sprzęt diagnostyczny wykrywa i moduluje zdrowe i destrukcyjne fale w ludzkim ciele, a także leki i inne substancje poprzez ich wibracje. Kilka badań klinicznych wykazało, że niewystarczające i bezpieczne poziomy pól elektromagnetycznych modulowanych amplitudą stosowane przez doustną sondę w kształcie łyżki mogą wywoływać właściwości diagnostyczne i lecznicze ( 9 ).

Pomimo pozytywnego wpływu różnych pól elektrycznych i elektromagnetycznych w naukach medycznych, zastosowanie tej technologii zostało ograniczone do określonych dziedzin ( 10 , 11 ).

Niniejsze badanie miało na celu porównanie wyników techniki specyficznej częstotliwości modulacji (SMF) w porównaniu z elektroforezą i RT-PCR w wykrywaniu FCoV u kotów.

2. Materiały i metody

2.1. Próbki

Próbki krwi pobrano od 30 chorych kotów (11 samic i 19 samców w wieku od 2 do 24 miesięcy) podejrzanych o FIP na podstawie objawów klinicznych (Tabela 1). Próbki te uzyskano losowo z różnych klinik weterynaryjnych na zachodzie Teheranu w latach 2020-2022. Próbki surowicy pobierano przez wirowanie (10 minut w temperaturze 2500 g) i utrzymywano w temperaturze -20°C do czasu analizy.

2.2. Elektroforeza

Elektroforezę przeprowadzono na żelach agarozowych przy użyciu systemu Major Science (CA, USA), zgodnie z instrukcjami producenta. Krótko, 10 µl próbki surowicy poddano elektroforezie buforem TBE o pH 8,6, 100 V przez 35 minut na 1% żelu agarozowym. Żele analizowano na densytometrze obrazowym Bio-Rad GS-700 przy użyciu producenta Multi-Analyst ® /PC (Bio-Rad, Hemel Hempstead, Wielka Brytania). Stężenie poszczególnych frakcji oznaczono przez pomnożenie procentowej objętości frakcji przez całkowite stężenie białka w próbce zmierzone metodą biuret.

2.3. Przygotowanie próbki do RT-PCR

Maksymalnie 1 ml nie koagulowanej krwi kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) wirowano przez 10 minut przy 2500 obr. / min. Osocze usunięto z osadu komórkowego, a ekstrakcję RNA przeprowadzono na osoczu komórkowym.

2.4. Odwrotna Transkryptaza-Reakcja Łańcuchowa Polimerazy

2.4.1. Ekstrakcja i oczyszczanie RNA

Wirusowe RNA ekstrahowano z próbek krwi zgodnie z zestawem YTzol Pure RNA, opartym na protokole producenta (Yekta TajhizAzma, Iran).

W sumie 300 µl granulki komórkowej i 300 µl Trizolu dodano do mikrorówki, energicznie wymieszano i pozostawiono w temperaturze pokojowej na 5 minut. Następnie do mieszaniny dodano 0,2 ml chloroformu na 1 ml odczynnika YTzol (60 µl). Probówki wytrząsano energicznie przez 15 sekund i inkubowano przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Próbki odwirowywano w temperaturze 12 000 g w temperaturze 4°C. po odwirowaniu mieszaninę rozdzielono na niższą żółtą fazę fenolowo-chloroformową, interfazę i bezbarwną górną fazę wodną. RNA pozostawał wyłącznie w fazie wodnej i wytrącał się z fazy wodnej przy użyciu 150 µl alkoholu izopropylowego. Próbki inkubowano w temperaturze pokojowej przez 10 minut i odwirowywano w temperaturze 12 000 g przez 5 minut w temperaturze 4°C. alkohol wyrzucano, a następnie 1 ml etanolu 75% dodano do mikrotub i delikatnie wymieszano. Następnie mieszaninę odwirowywano w temperaturze 12 000 g przez 2 minuty w temperaturze 4°C. Mikrotuby utrzymywano w temperaturze pokojowej przez 6 minut po wyrzuceniu alkoholu. Na koniec dodano 30 µl sterylnej wody destylowanej i utrzymywano w temperaturze 55°C przez 10 minut, a następnie przechowywano w temperaturze -70°C.

2.4.2. Wybór Podkładu

Startery oligonukleotydowe wybrano z wysoce konserwowanej sekwencji genu M (Starter 212) genomu FCoV w połączeniu ze starterem ukierunkowanym na sekwencję lidera genomu FCoV (Starter 1179). Sekwencje starterów przedstawiono w tabeli 2 (12).

2.4.3. Odwrotna Transkrypcja

Zestaw do syntezy cDNA (Vivantis, Selangor, Malezja) został użyty do zapewnienia niezawodnej syntezy pełnej długości cDNA. Procedura została przeprowadzona zgodnie z wytycznymi dostarczonymi przez producenta zestawu. W przypadku reakcji RT 3 µl roztworu RNA i 3 µl odwrotnego startera 212 miesza się, inkubuje przez 2 minuty w 95? C i natychmiast chłodzi na lodzie. Mieszaninę syntezy cDNA przygotowano w następujący sposób: 1 µl dNTPs, 0,5 µl mmlv rewers, 1 µl MMLV bufor i 7,5 µl wody wolnej od nukleaz. Mieszaninę reakcyjną odwirowano i inkubowano przez 60 minut w 37?C. Enzym inaktywowano przez inkubację w temperaturze 95°C przez 5 minut. Następnie do próbek dodano 280 µl wody wolnej od nukleaz i przechowywano je w temperaturze -20°C przed użyciem w teście mRNA PCR.

2.4.4. Reakcja Łańcuchowa Polimerazy

Po RT do testu PCR zastosowano mieszankę główną Ampliqon (Odense M, dania), w tym 12,5 µl ampliqon master mix, 1 µl primer 212, 1 µl primer 1179, 5 µl primer cDNA i 5,5 µl wody wolnej od nukleaz. Protokół cyklu temperaturowego obejmował 10-minutową inkubację w 95?C, po której następowały 30 cykli 1-minutowej denaturacji w 95? C, 1-minutowe wyżarzanie startera w 62? C i 30-sekundowe przedłużenie startera w 72? C. Po 30 cyklach następowało 5 minut w 72?C, a na koniec mieszaninę reakcyjną ochłodzono do 4? C.

2.4.5. Analiza produktów wzmacnianych

W sumie 10 µl każdej próbki PCR analizowano za pomocą elektroforezy przy użyciu 1,5% żelu agarozowego tris-octan-EDTA (CinnaGen Co., Karaj, Iran) przez 40 minut przy 100 V. do kontroli wielkości amplifikowanego produktu PCR użyto markera masy cząsteczkowej 100 Pz (Sinaclon, Karaj, Iran). Po elektroforezie żel zanurzono w 10 mg/ml bezpiecznego roztworu barwiącego (Sinaclon, Karaj, Iran). Po barwieniu przez 15 minut żel sfotografowano pod oświetleniem UV. Produkty wzmacniające zostały sfotografowane przy użyciu żelu Bio-Rad Doc 1000 (Bio-Rad Laboratories, Inc).

2.5. Specyficzna Częstotliwość Modulacji

Przypadki zostały ocenione za pomocą SMF zgodnie z instrukcjami firmy produkcyjnej (MINI-EXPERT-DT, Rosja). Aktualny pomiar urządzenia wynosił 6 micro A@ 100 kOhm. Urządzenie ma możliwość zastosowania impulsów elektrycznych jako dodatnich, ujemnych i dwubiegunowych w zakresie częstotliwości od 0,1 do 15 KHz i zakresie od 1 do 20 V. Dla współdetekcji amplituda impulsu i częstotliwość impulsu zostały dostosowane odpowiednio do 12 V i 793/562 Hz. Do analizy danych wykorzystano oprogramowanie IMIDIS-EXPERT (IMEDIS-EXPERT, Rosja).

2.6. Analiza Danych

W niniejszym badaniu zgodność między testami a złotym standardem (połączenie PCR, elektroforezy, wyników biorezonansu) obliczono metodą współczynnika Kappa. Zastosowano również test Chi-kwadrat i tabele krzyżowe między testami.

W celu zaprojektowania modelu predykcyjnego i zmierzenia zależności między testami a złotym standardem obliczono również jednowymiarową czułość i swoistość każdego testu oraz pole pod krzywą (AUC) za pomocą krzywej charakterystyki pracy odbiornika (ROC).

Do analizy danych wykorzystano oprogramowanie SPSS (wersja 27) i oprogramowanie GraphPad Prism (wersja 9), A P<0,05 uznano za poziom istotności.

3. Wyniki

3.1. Wykrywanie FCOV oparte na PCR

Rysunek 1 przedstawia wyniki elektroforezy żelowej metody PCR w wykrywaniu FCoV.

3.2. Wykrywanie Fcov oparte na SMF

Rysunek 2 przedstawia wyniki SMF dotyczące diagnozy FCoV u kotów.

3.3. Wyniki trzech metod diagnostycznych:

Wyniki trzech metod diagnostycznych wykrywania FCoV i połączone wyniki uważane za złoty standard przedstawiono w tabeli 3.

3.4. Porównanie metod diagnostycznych

3.4.1. Współczynnik Kappa

Współczynnik Kappa przedstawiony w tabeli 4 wyraża korelację między każdym testem a złotym standardem.

AUC każdego testu obliczono na podstawie krzywej ROC. AUC elektroforezy, PCR i biorezonansu obliczono odpowiednio jako 0,853, 0,717 i 0,909 (Rysunek 3 I Tabela 5).

4. Dyskusja

Diagnoza FIP jest wyzwaniem w weterynarii. Ten raport opisuje test biorezonansowy do wykrywania FCoV u kotów. W tym badaniu porównano dokładność kliniczną elektroforezy, RT-PCR i biorezonansu do wykrywania FCoV u dotkniętych kotów.

Wzór elektroforetyczny FIP charakteryzuje się zwykle wzrostem frakcji Alfa (α)2 i gamma (γ)-globuliny. W eksperymentalnie indukowanym FIP frakcja α2-globuliny gwałtownie wzrasta z powodu zwiększonego stężenia białek ostrej fazy w osoczu. Z drugiej strony frakcja γ-globuliny wzrasta po około dwóch tygodniach, gdy wystąpią objawy kliniczne. Nieprawidłowe wzorce elektroforetyczne stwierdzono ostatnio u 95,1% kotów dotkniętych FIP, z których większość wykazywała zwiększoną frakcję γ-globuliny. Elektroforeza białek surowicy może ujawnić zarówno poliklonalną, jak i monoklonalną hipergammaglobulinemię, jak również wzrost białek ostrej fazy ( 13 ).

Giori, Giordano ( 14 ) zgłosili czułość i swoistość elektroforezy SPE w diagnostyce FIP odpowiednio 37,5% i 50%. W innym badaniu Stranieri, Giordano (15) zgłosił czułość i swoistość SPE odpowiednio 43% i 90%. Wyniki tych badań nie są zgodne z obecnymi wynikami. Thayer, Gogolski ( 16 ) zgłosił czułość 9-77% i swoistość 88-100% dla SPE, które są podobne do obecnych ustaleń.

W niniejszym badaniu czułość i swoistość SPE obliczono odpowiednio na 70,6% i 100%. Różnicę między wynikami niniejszego badania a wynikami innych można przypisać różnicy między stosowanymi standardami złota (immunohistochemia w wyżej wymienionych badaniach i połączone wyniki elektroforezy, biorezonansu i PCR w tym badaniu).

Techniki oparte na PCR zyskują na znaczeniu w diagnozowaniu wielu chorób zakaźnych, a FIP nie jest wyjątkiem. Ponieważ wyraźne markery genetyczne FIPV są nadal nieznane, wyniki należy interpretować ostrożnie.

Stranieri, Giordano ( 15 ) poinformował, że 3′-UTR PCR miał 75% czułość i 100% swoistość na próbkach krwi. W innym badaniu Felten, Leutenegger ( 17 ) zgłosili czułość, ujemną wartość predykcyjną( NPV), ogólną dokładność i częstość występowania RT-PCR w czasie rzeczywistym w surowicy / osoczu jako 0-23%, 3.8-43.4%, 3.8-43.4%, 82.4%, odpowiednio.

Hartmann, Binder (18) podał dodatnią wartość predykcyjną RT-PCR w surowicy jako 0,90%, NPV: 0,47%, swoistość: 0,88% i czułość: 0,53%. Wyniki te różnią się od obecnych ustaleń.

Różnicę między obecnymi wynikami PCR a innymi można przypisać celowaniu w różne regiony genomowe FCoV, różne materiały zestawu do syntezy cDNA i różne protokoły cykli temperaturowych.

Od 1970 r. terapia biorezonansowa MORA jest stosowana na całym świecie w kontekście medycyny komplementarnej dla różnych wskazań. W ostatnich latach terapia biorezonansowa okazała się wykonalnym leczeniem w kilku patologiach, stosowanym zarówno jako uzupełnienie terapii klasycznej, jak i niezależnie ( 8 ).

Badtieva, Pavlov (19) poinformował, że terapię biorezonansową można uznać za metodę korekcji zespołu przetrenowania u sportowców o zwiększonej aktywności współczulnego układu nerwowego.

Zgodnie z ustaleniami uzyskanymi przez Pihtili, Galle ( 8 ), terapia biorezonansowa jest klinicznie skuteczna w rzucaniu palenia i nie wykazuje żadnych niepożądanych skutków ubocznych.

Muresan, Salcudean ( 20 ) poinformował, że terapia biorezonansowa może być przydatna w leczeniu nawracających poważnych zaburzeń depresyjnych z umiarkowanymi epizodami depresyjnymi, niezależnie lub jako` terapia uzupełniająca leki przeciwdepresyjne.

Quasi-eksperymentalne badanie zostało przeprowadzone przez Karakos, Grigorios ( 21) w celu zbadania, czy biorezonans miał wpływ na objawy pacjentów. W badaniu wzięło udział 311 pacjentów z lekarzy i laboratoriów koordynujących biologię w Atenach, Salonikach, Volos i Xanthi. Próba badania obejmowała zarówno mężczyzn (120 osób, 38,58%), jak i kobiety (191 osób, 61,42%) w wieku 2-76 lat. Pacjenci leczeni zgłaszali objawy głównie z nosa, a następnie z oczu, układu oddechowego, skórnego i żołądkowo-jelitowego. Większość z nich (90%) nie wykazywała żadnych objawów lub wykazywała znaczną poprawę objawów po okresie 12 miesięcy leczenia biorezonansowego. Doszli do wniosku, że interwencja biorezonansowa miała znaczący wpływ na poprawę objawów.

Jeśli chodzi o wyniki niniejszego badania, zastosowanie biorezonansu w diagnozowaniu FIP można ocenić jako skuteczne. Wyniki biorezonansu (AUC 0,909, w porównaniu do 0,853 dla elektroforezy i 0,717 dla PCR) wydają się obiecujące w diagnostyce FIP.

Istnieje niewiele badań związanych ze skutecznością biorezonansu w weterynarii. Według najlepszej wiedzy autorów jest to pierwszy raport na temat skuteczności biorezonanu w diagnostyce FIP. Zgodnie z wynikami tego badania biorezonans jest praktyczną i wiarygodną metodą diagnozowania FIP, która jest wyzwaniem w diagnostyce medycyny weterynaryjnej.”