NOB – Zwalczanie biofilmu bakteryjnego

#biorezonans#biofilm#bakterie

Skuteczne zastosowanie biorezonansu w zwalczaniu biofilmu bakterii chorobotwórczych.

WPŁYW REZONANSOWYCH PÓL ELEKTROMAGNETYCZNYCH NA TWORZENIE BIOFILMU PSEUDOMONAS AERUGINOSA

EFFECTS OF RESONANT ELECTROMAGNETIC FIELDS ON BIOFILM FORMATION IN PSEUDOMONAS AERUGINOSA

by Janus A. J. Haagensen 1,Michael Bache 2,Livio Giuliani 3 andNikolaj S. Blom 2,4,*ORCID

1

Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Technical University of Denmark (DTU), Building 220, Kemitorvet, 2800 Kongens Lyngby, Denmark

2

Department of Chemical Engineering, Technical University of Denmark (DTU), Soltofts Plads 228A, 2800 Kongens Lyngby, Denmark

3

Steering Committee, International Commission for Electromagnetic Safety (ICEMS), Viale Venezia 7, 30171 Venice, Italy

4

Department of Biotechnology and Biomedicine, Technical University of Denmark (DTU), Soltofts Plads 221, 2800 Kongens Lyngby, Denmark

STRESZCZENIE

Globalny wzrost oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) stanowi przyszłe zagrożenie dla zdrowia i dyktuje potrzebę zbadania alternatywnych i niechemicznych podejść. Celem tego badania było zbadanie wykorzystania słabych rezonansowych pól elektromagnetycznych jako metody zakłócania tworzenia biofilmu przez patogenną bakterię u pacjentów z mukowiscydozą. Opracowaliśmy laboratoryjną konfigurację biorezonansu zdolną do rozróżnienia między zmianami we rozroście planktonicznym a zmianami w tworzeniu biofilmu i wykazaliśmy, że niektóre częstotliwości rezonansowe były w stanie wpływać na tworzenie biofilmu bez wpływu na wzrost bakterii planktonicznych. Ponadto wykazaliśmy, że codzienne pole magnetyczne otoczenia wpływa na tworzenie się biofilmu w niespójny sposób. Ogólnie rzecz biorąc, doszliśmy do wniosku, że nasz test jest odpowiedni do badania potencjału rezonansowych pól magnetycznych jako strategii leczenia i zapobiegania infekcjom biofilmowym oraz że niektóre częstotliwości rezonansowe mogą być wykorzystywane w przyszłych zastosowaniach medycznych do zwalczania oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe.

Słowa kluczowe:

BIOREZONANS; OPORNOŚĆ PRZECIWDROBNOUSTROJOWA; BIOFILM MIKROBIOLOGICZNY; INFEKCJA; REZONANS CYKLOTRONÓW JONOWYCH

1. WPROWADZENIE

Powszechne stosowanie antybiotyków doprowadziło do wzrostu oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR), czego przykładem są patogenne bakterie Staphylococcus aureus oporne na metycylinę (MRSA) i Pseudomonas aeruginosa, przy czym ta ostatnia jest głównym wyzwaniem dla pacjentów z mukowiscydozą[1]. Obecnie stanowi to zagrożenie dla osób z upośledzonym układem odpornościowym, a jutro może stanowić zagrożenie dla całej ludzkości[2]. W związku z tym istnieje pilna potrzeba i wyścig z czasem w celu odkrycia i wynalezienia nowych związków lub metod zwalczania zagrażających życiu chorób zakaźnych, nie tylko w odniesieniu do patogenów bakteryjnych, ale także patogenów wirusowych, o czym świadczy obecnie (anno 2020) globalna pandemia COVID-19.

Fizyka kwantowa wykazała, że podstawowe składniki natury istnieją zarówno jako cząstki, jak i fale. Medycyna i biologia odniosły duży sukces w leczeniu życia z perspektywy cząstek, co może wyjaśniać, dlaczego falowy aspekt biologii został w dużej mierze zaniedbany i uznany za nieistotny, a nawet kontrowersyjny. Może to wynikać z trudności w replikowaniu eksperymentów i przekonania, że promieniowanie nietermiczne nie wpływa na żywe systemy. Jednak dobrze wiadomo, że słabe siły, rezonujące z odpowiednią częstotliwością, mogą mieć silne skutki, o czym świadczą głosy śpiewaków operowych rozbijające kryształowe kieliszki i stabilne wiatry zawalające mosty wiszące. Co więcej, rytmy odgrywają fundamentalną rolę w żywych systemach, a rytmy są muzycznym wyrazem modulacji częstotliwości[3].

Eksperymenty pokazują obecnie, że niskoenergetyczne, wysoce specyficzne rezonansowe pola elektromagnetyczne (EMF) wpływają na żywe systemy, np. indukując różnicowanie komórek macierzystych lub zakłócając wzrost bakterii [4,5]. Medyczny przełom terapeutyczny nastąpił w 2011 roku, kiedy to pierwsza terapia oparta na polu rezonansowym w leczeniu guzów mózgu u pacjentów w stanie terminalnym została zatwierdzona do użytku klinicznego przez FDA (recenzja w[6]).

ZWIĄZEK MIĘDZY REZONANSOWYMI POLAMI ELEKTROMAGNETYCZNYMI, KOHERENCJĄ W WODZIE I EFEKTAMI BIOLOGICZNYMI

Mechanistyczne zrozumienie tych zjawisk nie stoi za obserwowalnymi efektami; jednak elementy zaczynają się łączyć.

Przełom nastąpił w latach 1980-1990, kiedy naukowcy z USA i Rosji niezależnie wykazali, że słabe pola magnetyczne o ekstremalnie niskiej częstotliwości (ELF) o określonych częstotliwościach, dostrojone do stosunku ładunku i masy cząsteczek rozpuszczonych w roztworze wodnym, są w stanie indukować pik prądu elektrycznego w ogniwie elektrolitycznym[7,8]. Cząsteczki te obejmowały biologicznie istotne jony, aminokwasy i kwasy nukleinowe, ustanawiając w ten sposób związek między jonowym rezonansem cyklotronowym (ICR) a żywymi systemami opisanymi równaniem (1): częstotliwość ICR, ωc, jest wyrażona jako funkcja stosunku ładunku jonu do masy (z/m) i natężenia statycznego pola magnetycznego B:

Równanie (1):

𝜔𝐶=𝑧𝐵/2𝜋𝑚

Twierdzenie i obserwacje, że indukowana siła Lorentza o wiele rzędów wielkości mniejsza niż siła Browna powinna mieć wpływ na określone jony, były kwestionowane przez długi czas[9], dopóki nowe teorie wody nie wysunęły się na pierwszy plan w ramach elektrodynamiki kwantowej (QED). Teoria ta głosi, że woda jest cieczą dwufazową, zawierającą fazę spójnych, samoorganizujących się skupisk cząsteczek, zdolnych do magazynowania dodatkowej energii, analogicznie do spójnej formy światła znanej jako laser[10]. Spójne klastry lub domeny migoczą i znikają w ciągu dziesiątych części pikosekund. Tylko klastry stabilizowane przez powierzchnie mają wystarczająco długi czas życia, aby przechowywać i uwalniać energię z otoczenia[11,12]. Eksperymentalne dowody tej teorii zostały poparte wynikami badań przy użyciu różnych metod spektroskopowych, w tym spektroskopii w podczerwieni i bliskiej podczerwieni oraz badań rentgenowskich przechłodzonej wody[13,14,15,16].

Jak cytowano powyżej[9], Adair R.K. wcześnie sformułował twierdzenie, że słabe pole elektromagnetyczne w paśmie ELF (≤60 Hz) indukuje siłę Lorentza w wodzie, która jest o kilka rzędów wielkości niższa niż siła Browna w temperaturze pokojowej. Jeśli weźmiemy pod uwagę, że cytoplazma jest kąpielą, w której kilka gatunków cząsteczek jest rozpuszczonych w roztworze wodnym, powinniśmy zatem dojść do wniosku, że żadna reakcja chemiczna nie może zajść w cytoplazmie z powodu słabego pola elektromagnetycznego. Jednak teoria Adair R.K. została sformułowana w ramach fizyki klasycznej i zanim QED został w pełni rozwinięty w celu opisania spójności w materii[17]. Istniało również fałszywe przekonanie, że fizyka kwantowa nie może mieć zastosowania do makroskopowego zjawiska żywej materii, pomimo wczesnego ostrzeżenia Erwina Schrödingera [18]. W 2002 roku opublikowano pierwsze wyjaśnienie[19] mechanizmu kwantowego leżącego u podstaw tego efektu, opisanego wcześniej przez Liboffa A.R.[7]. Opisuje ono powstawanie prądów jonowych w wodzie pod wpływem jonowego rezonansu cyklotronowego (ICR) wywołanego słabym polem elektromagnetycznym w paśmie ELF w obecności statycznego pola magnetycznego (rzędu pola geomagnetycznego) oraz statycznego pola elektrycznego rzędu pola występującego w błonie komórki eukariotycznej (około -100 mV).

Kluczową kwestią było jednak rozszerzenie mechanizmu na biomolekuły, tj. bioaktywne jony lub zwitteriony (dipole) w komórkach prokariotycznych lub eukariotycznych. W 2006 r. Zhadin i wsp. wykazali, że słaby sygnał elektromagnetyczny w paśmie ELF jest rzeczywiście w stanie wyzwolić uwalnianie bioaktywnych cząsteczek i prądów jonowych[20].

Mechanizm efektu Zhadina można podsumować w trzech krokach: (1) po pierwsze, zwitteriony i jony są wychwytywane przez spójne klastry i znajdują się na granicy, pod warunkiem, że ich piki absorpcyjne są zbliżone do pików wody (głównie do pików odpowiadających wzbudzeniu elektronowemu lub drganiom fononów); (2) wewnątrz klastra, zwitteriony są jonizowane w wyniku działania wysokiego gradientu wektorowego potencjału elektromagnetycznego, na granicy klastra wody[21]; oraz (3) pod wpływem odpowiedniego pola magnetycznego ICR, jony uciekają, dostarczane przez energię klastra, i są przyspieszane przez pole elektryczne, dostarczane przez transmembranowy gradient elektryczny. Ponadto efekt Zhadina opiera się na zwiększeniu przewodnictwa roztworu wodnego, tak zwanej protonacji wody, jak szczegółowo opisano w sekcji dyskusyjnej[5,22].

Zakładając to wszystko, postawiliśmy hipotezę, że komórki prokariotyczne, takie jak bakterie, powinny również podlegać interakcji elektromagnetycznej zapewnianej przez rezonans cyklotronowy jonów i argumentowaliśmy, że ICR powinien oddziaływać inaczej na komórki prokariotyczne bakterii i na wydzielany biofilm ze względu na różną zawartość wody.

Rzeczywiście, pionierskie badania wykazały, że ekspozycja na pola elektryczne i elektromagnetyczne wpływa na wzrost bakterii planktonicznych i tworzących biofilm oraz może zwiększać skuteczność antybiotyków[23,24]. Obejmuje to patogen bakteryjny Pseudomonas aeruginosa, który kolonizuje płuca pacjentów z mukowiscydozą i zmniejsza ich pojemność płuc. W tym pilotażowym badaniu eksploracyjnym wybraliśmy P . aeruginosa i zbadaliśmy, czy bakterie wystawione na działanie oscylującego, impulsowego pola elektromagnetycznego o ekstremalnie niskiej intensywności i częstotliwości mają wpływ na ich wzorzec wzrostu i zdolność do przylegania do powierzchni i ostatecznie tworzenia biofilmu.

W większości eksperymentów laboratoryjnych warunki kontrolne odnoszą się do sytuacji, na którą nie mają wpływu zmienne warunki, takie jak czynniki chemiczne i fizyczne. Jednak pole otoczenia elektromagnetycznego rzadko jest brane pod uwagę, ale może się zmieniać z dnia na dzień. Zmiany w burzach słonecznych lub elektrycznych, warunki geomagnetyczne, pobliskie urządzenia telekomunikacyjne lub aktywność dużego sprzętu (zamrażarki, wirówki itp.) mogą wpływać na lokalne i otaczające środowisko elektromagnetyczne. Wyzwanie to zostało rozwiązane poprzez zastosowanie komory amagnetycznej ze stopu metalu mu, ekranującej zewnętrzne pola magnetyczne o niskiej częstotliwości.

Po przeprowadzeniu eksperymentów pilotażowych stwierdziliśmy, że najbardziej stabilne wyniki uzyskano przy użyciu częstotliwości ICR jonu potasu, K+, przy określonej sile statycznego pola magnetycznego (10 mikroT). Obserwacja, że celowanie w biologicznie ważny jon K+ może modyfikować fizjologię bakterii, została również potwierdzona w poprzednim badaniu[24].

2. MATERIAŁY I METODY

2.1. LABORATORIUM BIOREZONANSU

Utworzono laboratorium biorezonansu, składające się z pomieszczenia o kontrolowanej temperaturze (37 °C) wyposażonego w ekranowaną cylindryczną komorę ekspozycyjną wykonaną ze stopu metalu Mu (długość 68 cm, średnica 22 cm; model ZG209, Magnetic Shield Corporation, Bensenville, IL, USA) (patrz rysunek 1). Wyjściowe natężenie pola magnetycznego wewnątrz ekranowanej komory ekspozycyjnej zostało zredukowane do mniej niż 60 nanoTesli, co stanowi prawie tysiąckrotną redukcję w stosunku do pola geomagnetycznego otoczenia wynoszącego ok. 40 mikroTesli.

Rysunek 1. Laboratorium biorezonansu ma temperaturę 37 °C i zawiera generator funkcyjny (po lewej), magnetometr (w środku), trójwarstwowy amagnetyczny cylinder z mu-metalu (po prawej) oraz wykonany na zamówienie solenoid (czerwony/biały, na dole), który mieści się wewnątrz cylindra z mu-metalu.

2.2. SYSTEM EKSPOZYCJI I PROCEDURA

Wykonana na zamówienie cewka/solenoid Helmholtza została wykonana z twardej rury PVC (o średnicy 20 cm i długości 60 cm) i uzwojenia z drutu miedzianego podłączonego do generatora funkcyjnego. Generowane pola były monitorowane za pomocą wykonanego na zamówienie magnetometru (dokładność: +/-56 nT). Podczas ekspozycji bakterii stosowano statyczne pola magnetyczne w zakresie 10-40 mikroTesli i zmienne pola w zakresie 100-300 nanoTesli. Częstotliwości pola zmiennego mieściły się w zakresie 3-13 Hz.

Ekspozycja była kontrolowana przez generator funkcyjny (model RS Pro 5 MHz AFG-21100) dostarczający pole DC od 10 do 30 mikroTesli (odpowiadające 0,73 do 2,55 V DC) i nałożone pole AC od 130 do 300 nanoTesli (przy 3,9 do 11,7 Hz/0,130 do 0,390 V AC).

W badaniu zastosowano następujące warunki ekspozycji: (1) ekspozycja wewnątrz komory amagnetycznej przez określone pole DC i określone pole AC o danej częstotliwości („eksponowany”); (2) zerowa ekspozycja lub ekranowanie wewnątrz komory amagnetycznej („zero”); lub (3) ekspozycja na pole otoczenia poza komorą na stanowisku laboratoryjnym („otoczenie”).

Większość ekspozycji przeprowadzono przy użyciu częstotliwości 3,9 Hz, odpowiadającej ICR K+ w statycznym polu magnetycznym 10 uT zgodnie z równaniem (1). Wybór kationu potasu K+ jako głównego celu opierał się na ustaleniach zaobserwowanych przez Di Bonaventura i in., które wykazały, że ICR K+ ma znaczący wpływ biologiczny[24].

2.3. WZROST MIKROBIOLOGICZNY I TEST BIOFILMU

Eksperymenty przeprowadzono przy użyciu tworzącego biofilm szczepu bakteryjnego Pseudomonas aeruginosa, PAO1, i oparto na teście adhezji biofilmu w 96-dołkowych płytkach mikromiareczkowych z pokrywką opisanych wcześniej[25].

2.3.1. STANDARYZACJA INOKULUM

Każde badanie rozpoczęto od całonocnej hodowli bakteryjnej P. aeruginosa (PAO1) wyhodowanej w pożywce LB, rozcieńczonej do OD600 = 0,05 i 150 mikrolitrów podzielono na 96-dołkowe płytki mikrotitracyjne (Nunclon Delta Surface Cat. No.167008, Nunc TSP Cat. No.445497, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami[26].

2.3.2. TEST NA WZROST BAKTERII PLANKTONICZNYCH

Po 20 godzinach inkubacji monitorowano wzrost bakterii planktonicznych, mierząc OD600 dla każdej studzienki za pomocą czytnika płytek (Synergy H1, BioTek, Agilent, Santa Clara, CA, USA).

2.3.3. TEST ADHEZJI BIOFILMU DO KOŁKÓW POLISTYRENOWYCH

Zdolność szczepów PAO1 do przylegania i tworzenia biofilmów na kołkach polistyrenowych analizowano za pomocą barwienia fioletem krystalicznym, jak opisano wcześniej[27]. W skrócie, bakteriom pozwolono rosnąć przez 20 godzin w statycznym systemie kołek-pokrywka. Następnie pokrywkę z kołkami przeniesiono do „płytki mikromiareczkowej do przemywania” z 180 μl roztworu soli fizjologicznej (PBS) w celu przemycia kołków i usunięcia nieprzylegających komórek. Pokrywkę z kołkami przeniesiono następnie do płytki mikrotitracyjnej z 160 μL 0,1% fioletu krystalicznego (CV) i pozostawiono do barwienia na 20 minut. W celu usunięcia niezwiązanego fioletu krystalicznego, pokrywki były następnie trzykrotnie płukane w trzech oddzielnych „płytkach mikrotitracyjnych do płukania” za pomocą 180 μL PBS. Adhezję bakterii do wieczka mierzono poprzez oderwanie przylegających komórek zabarwionych CV poprzez umieszczenie wieczek w płytce mikrotitracyjnej zawierającej 180 μL 99% etanolu. Następnie użyto czytnika płytek (Synergy H1, BioTek, Agilent, Santa Clara, CA, USA) do pomiaru gęstości optycznej CV przy OD590.

2.3.4. OBLICZANIE WZGLĘDNYCH JEDNOSTEK ADHEZJI BIOFILMU

Względne tworzenie biofilmu lub jednostki adhezji obliczono jako stosunek OD590/OD600 dla danej studzienki na danej płytce, jak opisano wcześniej[25]. Względne jednostki adhezji biofilmu dla danej płytki znormalizowano do kontroli ekranowanej („zerowej”), a analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą testu t.

3. WYNIKI

3.1. WZROST BAKTERII PLANKTONICZNYCH NIE ZMIENIA SIĘ STATYSTYCZNIE W RÓŻNYCH WARUNKACH POLA MAGNETYCZNEGO

W serii eksperymentów komórki PAO1 na płytkach mikrotitracyjnych były narażone na działanie pola otoczenia („otoczenie”), pola ekranowanego („zero”) lub określonego pola elektromagnetycznego o częstotliwości 3,9 Hz („narażone”), jak opisano powyżej. W niektórych seriach pominięto warunki otoczenia.

Nie zaobserwowano różnicy w bezwzględnym tempie wzrostu (dane nie pokazane). Po 20 godzinach ekspozycji wzrost bakterii planktonicznych został zarejestrowany jako wartości OD600 i znormalizowany do wartości dla warunków „ekranowanych/zero” dla tej serii (ustawionej na 100). Dla poszczególnych dołków w płytce mikrotitracyjnej, hodowanych w identycznych warunkach, maksymalne odchylenie standardowe wynosiło 14%.

Rysunek 2 przedstawia znormalizowane średnie wartości wzrostu bakterii planktonicznych dla każdego z trzech warunków eksperymentalnych. Płytki w otoczeniu i naświetlane wykazywały wartości odpowiednio 98 i 105, po znormalizowaniu do warunków osłoniętych (wartość 100). Średnia z kilku serii eksperymentalnych dla każdego warunku wykazała stałe odchylenie standardowe wynoszące 12% we wszystkich przypadkach.

Podsumowując, nie zaobserwowano statystycznie istotnej różnicy we wzroście bakterii planktonicznych między warunkami eksperymentalnymi testowanymi w tym badaniu.

3.2. WPŁYW POLA ELEKTROMAGNETYCZNEGO OTOCZENIA NA TWORZENIE BIOFILMU BAKTERYJNEGO NIE JEST STAŁY

Aby przetestować wpływ otaczającego pola elektromagnetycznego na tworzenie biofilmu bakteryjnego, zbadano komórki PAO1 hodowane w warunkach otoczenia lub ekranowanych (hipomagnetycznych). W warunkach ekranowanych bakterie nie powinny wyczuwać nawet wpływu statycznego pola geomagnetycznego (typowo od 30 do 50 mikroTesli). Jeśli warunki otoczenia i ekranowania są różne, ale stałe, powinniśmy spodziewać się stałego stosunku tworzenia biofilmu między tymi dwoma warunkami.

Rysunek 3 przedstawia względne tworzenie biofilmu z kilku serii eksperymentów przeprowadzonych w okresie kilku miesięcy. Obliczone względne tworzenie się biofilmu w warunkach otoczenia przeprowadzonych w różnych terminach, w zakresie od 102% (seria A) do 133% (seria P) kontroli („Zero”).

Rysunek 3. Wpływ warunków otoczenia w porównaniu z warunkami osłoniętymi na jednostki adhezji biofilmu (stosunek OD590/OD600) i znormalizowane do warunków kontrolnych „zero/osłonięte (wartość 100)”. Punkty danych i odchylenia standardowe pokazane dla pięciu serii eksperymentalnych (A-R) w dwóch warunkach: „Otoczenie/pomieszczenie”, „Zero/osłona”. Oś Y pokazuje znormalizowane współczynniki biofilmu w stosunku do warunków „Zero/osłona” (wartość 100).

Podsumowując, względne tworzenie biofilmu przez komórki PAO1 hodowane w warunkach otoczenia nie wydawało się stałe w stosunku do warunków osłoniętych. W oparciu o to odkrycie, w kolejnych eksperymentach jako kontrolę zastosowano komórki wyhodowane w warunkach osłoniętych (zero).

3.3. TWORZENIE BIOFILMU JEST KONSEKWENTNIE HAMOWANE PRZY OKREŚLONEJ CZĘSTOTLIWOŚCI

Bakterie PAO1 w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych poddano działaniu pola oscylacyjnego o częstotliwości 3,9 Hz (130 nanoT AC nałożone na 10 mikroT DC/pole statyczne) przez 20 godzin w sześciu różnych przypadkach (seriach). Jako kontrolę, bakterie PAO1 w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych pozostawiono nienaświetlone wewnątrz ekranowanej komory przez 20 godzin (oznaczone jako „Zero”).

Rysunek 4 pokazuje, że redukcja tworzenia biofilmu bakteryjnego była konsekwentnie obserwowana, gdy kultury PAO1 były narażone na działanie pola oscylacyjnego o częstotliwości 3,9 Hz. Średnią redukcję o 27% zaobserwowano w sześciu seriach eksperymentalnych w zakresie od 16% do 41% (patrz rysunek 4). Istotność statystyczną obliczono za pomocą testu t. Wartości p wahały się od p < 2 × 10-8 do p < 5 × 10-26, wykazując znaczące zmiany w tworzeniu biofilmu bakteryjnego po ekspozycji na pole oscylacyjne w porównaniu z kontrolą. Ponieważ każda płytka mikrotitracyjna składa się z 96 powtórzeń technicznych, stopnie swobody są znaczące, a tym samym wzmacniają obliczone wartości p.

Rysunek 4. Wpływ warunków osłoniętych i odsłoniętych na jednostki adhezji biofilmu (stosunek OD590/OD600) znormalizowany do warunków kontrolnych „Zero/Osłona”. Punkty danych z sześciu serii eksperymentalnych (A-G) pokazano w dwóch różnych warunkach: „Zero/ekranowanie” i „Ekspozycja/3,9 Hz”. Oś Y pokazuje znormalizowane wartości w odniesieniu do warunków „Zero/ekranowanie” (wartość 100). Odchylenie standardowe dla każdej płytki mikrotitracyjnej i statystyczne wartości p(sparowany test t) są wskazane (**** oznacza p < 0,0001).

Ponieważ nie miało to wpływu na wzrost bakterii planktonicznych (patrz rysunek 2), ekspozycja bakterii PAO1 na kombinację statycznego (DC) pola magnetycznego o natężeniu 10 mikroTesli nałożonego na oscylujące (AC) pole magnetyczne o częstotliwości 3,9 Hz i natężeniu 130 nanoTesli może wpływać na zdolność badanych komórek P. aeruginosa do przylegania, a tym samym do tworzenia zakaźnych biofilmów.

3.4. INNE TESTOWANE CZĘSTOTLIWOŚCI WYKAZAŁY ZMIENNE I NIEJEDNOZNACZNE WYNIKI

W celu dalszego zbadania możliwości ukierunkowania teoretycznego ICR K+ przeprowadzono eksperymenty z użyciem zestawu parametrów trzykrotnie większych, tj. pola statycznego 30 mikroT (3 × 10) i obliczonej częstotliwości ICR 11,7 Hz (3 × 3,9 Hz), zgodnie z równaniem (1).

Eksperymenty te były niejednoznaczne i bardzo zmienne (wyniki nie zostały przedstawione).

4. Dyskusja

Celem tego badania było stworzenie laboratorium biorezonansowego i zbadanie wykorzystania słabych rezonansowych pól elektromagnetycznych jako metody zakłócania tworzenia biofilmu in vitro znanej patogennej bakterii Pseudomonas aeruginosa jest patogenem, który dominuje u pacjentów cierpiących na mukowiscydozę, a każde nowe podejście do hamowania tworzenia zakaźnego biofilmu tej bakterii w płucach pacjentów z mukowiscydozą byłoby bardzo ważne i miałoby znaczenie kliniczne.

Podsumowując, uzyskano następujące trzy wyniki:

(1) brak wpływu ekranowanego lub specyficznego pola magnetycznego na wzrost bakterii planktonicznych, tj. nie tworzących biofilmu,

(2) zmienny lub niestały wpływ otaczającego lub środowiskowego pola elektromagnetycznego na tworzenie biofilmu bakteryjnego oraz

(3) hamujący wpływ na tworzenie biofilmu bakteryjnego przy określonej częstotliwości pola elektromagnetycznego.

W odniesieniu do pierwszego odkrycia, inni donosili, że pola elektryczne i magnetyczne mogą wpływać na wzrost bakterii planktonicznych (patrz[28] i odnośniki tam zawarte). Jednak w niniejszym badaniu nie zaobserwowano takiego efektu. Można argumentować, że OD600 niekoniecznie odpowiada liczbie żywych bakterii i może również obejmować martwe komórki. Jednak kilka żywych/martwych plam i krzywych wzrostu zostało wykonanych niesystematycznie, co wskazywało, że nie było różnic między warunkami eksperymentalnymi i że planktoniczne kultury bakteryjne rosły zgodnie z oczekiwaniami.

Drugie odkrycie dotyczyło otaczającego pola elektromagnetycznego. Analizując zdolność do tworzenia biofilmu na pokrywach kołków, stwierdzono, że otaczające lub środowiskowe pole elektromagnetyczne w naszym ośrodku badawczym miało niestały wpływ na tworzenie biofilmu bakteryjnego. W związku z tym nie można zakładać, że pole elektromagnetyczne otoczenia spowodowane zjawiskami naturalnymi i sztucznymi jest stałe od jednego okresu eksperymentalnego do drugiego. Na przykład w każdym współczesnym laboratorium sprzęt elektryczny, taki jak lodówki, sprzęt telekomunikacyjny itp., może wytwarzać nieistotne pole magnetyczne 50 Hz o natężeniu 500 nanoT lub większym. Dlatego ważne jest, aby kontrolować to zjawisko, na przykład za pomocą metalowego cylindra ekranującego przed otaczającymi polami magnetycznymi.

Badanie tworzenia się biofilmu bakteryjnego w przeciwieństwie do wzrostu planktonicznego może stanowić wyzwanie, ponieważ biofilm może tworzyć się na większości powierzchni, z którymi styka się kultura bakteryjna. W przypadku standardowych płytek mikrotitracyjnych, dno, boki i powierzchnie brzegowe są narażone na tworzenie się biofilmu. Stanowiło to duże wyzwanie dla wczesnych badań nad tworzeniem się biofilmu mikrobiologicznego, ponieważ bardzo trudno było oddzielić frakcje planktoniczne i przyczepione w standardowej studzience lub szalce. W 1999 r. wprowadzono zasadę peg-lid, która wykazała znacznie lepszą odtwarzalność, ze względu na możliwość łatwego oddzielenia określonej części powierzchni dostępnej (kołki) dla bakterii[29]. Ponadto zastosowanie 96-dołkowego formatu mikromiareczkowego zasadniczo pozwala na wykonanie 96 powtórzeń technicznych w jednej partii, a tym samym znacznie poprawia moc statystyczną.

Trzecie odkrycie w tym badaniu opierało się na zastosowaniu odpowiedniej kontroli i statystycznie wiarygodnego biologicznego testu peg-lid, jak opisano powyżej. Używając magnetycznie ekranowanej kultury bakteryjnej jako kontroli, stwierdzono, że wystawienie bakterii na działanie określonego pola elektromagnetycznego o natężeniu 10 mikroT i częstotliwości 3,9 Hz konsekwentnie wykazywało hamujące i statystycznie istotne zmniejszenie tworzenia biofilmu. Seria sześciu eksperymentów wykazała efekt hamujący, średnio o 27% zmniejszając tworzenie się biofilmu.

Określona częstotliwość 3,9 Hz została obliczona jako jonowy rezonans cyklotronowy (ICR) jonu potasu, K+, przy określonej sile pola magnetycznego. Stwierdziliśmy, że potrojenie pola magnetycznego i dostrojenie częstotliwości ICR nie wykazało takiej samej spójności, jak zaobserwowano przy użyciu częstotliwości 3,9 Hz. Można by się tego spodziewać, gdyby efekt rezonansu pochodził wyłącznie od pojedynczego gatunku jonów. Jednak, jak wspomniano wcześniej, zaobserwowane efekty są prawdopodobnie zależne od protonacji wody, a także biologicznie istotnego jonu, w tym przypadku K+.

Termin protonacja wody oznacza tutaj ekspozycję roztworu wodnego na częstotliwość ICR kationu Zündela, H3O+∙(H2O). We wcześniejszych badaniach nad polimorfizmem wody sugerowano rolę kationu Zündela, jednego z najobficiej występujących hydratów hydroniowych, jako źródła energii potrzebnej do aktywacji innych kationów. Zaobserwowano, że uwalnianie kationów Zündela i innych hydratów hydroniowych zwiększa przewodnictwo wody, zmniejszając pH i modyfikując jej współczynnik załamania, wzmacniając w ten sposób mały sygnał ICR i umożliwiając prądom jonowym wzbudzonym przez ICR pokonanie środowiskowej bariery termicznej, kT (gdzie k jest stałą Boltzmanna, a T temperaturą bezwzględną). Zaobserwowano również, że woda działa jako wzmacniacz w paśmie ELF, gdy hydraty hydroniowe są w stanie wzmocnić takie polimorfizmy[30,31]. Taki wpływ ICR na hydraty hydroniowe został potwierdzony w niniejszym eksperymencie dzięki zróżnicowanym wynikom w zależności od obecności składnika kationu Zündela w K+-ICR, który został podany bakteriom w sposób opisany poniżej.

Ponieważ statyczne pole magnetyczne (10 mikroT) konsekwentnie wykazywało wpływ na biofilm bakteryjny, spodziewamy się ICR K+ o częstotliwości 3,9 Hz i 4,1 Hz kationu Zündela, H3O+∙(H2O), a więc różnicy 0,2 Hz. Biorąc pod uwagę szerokość połówkową w połowie maksimum (HWHM), Ґ/2, może się różnić w zależności od wielu parametrów charakteryzujących rezonans, w tym współczynnika Q znanego z teorii odbioru fal radiowych. Wcześniej sugerowano, że HWHM jest rzędu 10-1 Hz, zapewniając w ten sposób wiarygodne wyjaśnienie aktywacji zarówno K+, jak i H3O+∙(H2O) przy użyciu pola statycznego 10 mikroT[8]. Jednakże, gdy wszystkie czynniki zostały potrojone, różnica w obliczonym ICR wzrosła do 0,6 Hz (3 × 0,2 Hz), co jest rzędu 1 Hz i może zmniejszyć wpływ pobliskich częstotliwości i powtarzalność eksperymentu.

Tak więc opisana tutaj metodologia może służyć jako punkt wyjścia do opracowania nowych strategii przeciwko rosnącemu globalnemu wyzwaniu oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe i wpływać na wyzwania kliniczne, takie jak przewlekłe infekcje wrzodów, cewników i dróg moczowych.

Przyszłe kierunki mogą obejmować synergiczne działanie rezonansowych pól magnetycznych i związków przeciwdrobnoustrojowych oraz warunki testowe naśladujące sytuacje istotne klinicznie. Mogą one obejmować tworzenie biofilmu w komorach przepływowych i zachowanie bakterii infekujących organoidy (małe sztuczne narządy). Badania molekularne i biochemiczne z wykorzystaniem metabolomiki, transkryptomiki i proteomiki mogą również wyjaśnić szlaki biochemiczne zaburzone przez rezonansowe pola magnetyczne.

5. Wnioski

Nasze odkrycia sugerują, że niektóre rezonansowe pola magnetyczne mogą zakłócać tworzenie się biofilmu drobnoustrojów, a tym samym stanowić niechemiczne narzędzie do zwalczania rosnącej oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. Wykazaliśmy również, że dedykowane laboratorium biorezonansowe wyposażone do badania kontrolowanych pól magnetycznych ekranowanych przed otaczającymi polami magnetycznymi jest wykonalne i potrzebne do przyszłych eksperymentów.

https://www.mdpi.com/2076-3417/11/16/7760